自己动手造显微镜？一不小心拿个诺贝尔奖可如何是好
定制显微镜，如图所示的等尺寸比例显示光片照明显微镜，使研究人员能够突破商业显微镜的限制
在费城宾夕法尼亚大学攻读生物工程博士学位时，韦斯利•勒戈特（Wesley Legant）遇到了一个令人沮丧的障碍：他有自己的想法，但能够将想法付诸实施的设备却尚未出现。
由于对细胞力学和细胞运动很感兴趣，勒戈特开始研发工具来测量细胞对环境的作用力。他在一个哺乳动物的增殖细胞周围的物质中嵌入了荧光微球，这样一来，当细胞移动时，其周围物质就会变形，从而推动荧光微球移动。通过测量荧光微球的移动距离，勒戈特可以计算出细胞施加的作用力。然而，他很难获得准确的数据。
细胞依靠自身能量缓慢移动——速度最快为每分钟几微米——因此，需要在很长一段时间里用显微镜观察这一细胞运动。为了跟踪记录三维立体的荧光微珠，勒戈特必须使整个系统在高空间分辨率下成像。那是在2010年左右，当时可用的商业显微镜——采用点扫描、涡流盘技术的共聚焦显微镜——无法完成上述工作。
比如有一个透明立方体。共聚焦显微镜可以让科学家们一个一个地捕捉到立方体中的每一个点，并逐渐形成一个三维影像。为此，共聚焦显微镜在样本中垂直地投射一束光，但是每一束光都会产生破坏样本的活性氧——也就是勒戈特所说的“光毒性”效应。与此同时，显微镜检测到的发光“荧光团”会随着时间的推移而逐渐消失——一种叫做光漂白的过程。
在勒戈特的实验中，每一幅三维影像大约需要1分钟的时间来获取。然后他又要再等5分钟——使细胞得以恢复，才能获取下一幅影像，这样才能在收集到所需数据之前使细胞避免由于光毒性而“逐渐消失”。勒戈特能够测量细胞所产生的作用力，但实验结果无法达到他想要的详细程度。
为解决上述问题，勒戈特在其博士后研究中改变了研究方向。在弗吉尼亚州阿什伯恩市的霍华德休斯医学研究所的珍妮莉娅法姆研究学院，勒戈特与物理学家兼显微镜专家埃里克•白兹格（Eric Betzig）一起工作，他还加入了一个规模虽小但正在不断发展壮大的自己动手制造（DIY）显微镜的社团。
制造显微镜是一项复杂而耗时的挑战，它需要一个拥有恰当技能组合的团队，来处理其中所涉及到的各种光束阵列、机械及计算机部件。
研究人员可以将定制设计，比如OpenSPIM.org网站上的设计，应用到不同的配置中
在珍妮莉娅法姆研究学院，研究人员突破了神经科学和发育生物学的界限。这些领域很大程度上依赖于显微镜和成像技术，而该研究学院拥有大量现成的商用显微镜。但是当这些显微镜无法满足研究需求时，研究者们并不是在等待着新型显微镜的发明——而是自己动手去制造。
珍妮莉娅法姆研究学院的一位物理学家菲利普•科勒（Philipp Keller）表示：“在科技发展中我们的工作动力是希望有一天能够实现现有显微镜无法进行的新型实验。”
2005年左右，在德国海德堡的欧洲分子生物学实验室工作时，科勒遇到了一个和勒戈特类似的问题：他想要跟踪一个发育中的斑马鱼胚胎的所有细胞，以了解它们是如何移动、合并形成不同的组织和器官的。但是当时使用的大多数显微镜，由于强烈的光照需要，都无法使这样大小的一个样本持续长时间成像——直径大约700微米的一团细胞。
于是，科勒转向了光片照明显微镜，这是当时刚开始使用的一种技术。光片照明显微镜不是照亮整个样本，而是将弱聚焦、低强度的光片直接投射到用户想要成像的物体的焦平面上。高品质相机可以在一次曝光中捕捉到整个焦平面，通过在样本中垂直移动平面，研究人员可以重现整个三维影像的物体。
科勒说：“光片照明显微镜是一种非常快速的成像技术，但同时也很温和。那些离焦的结构不会因暴露于光线中遭受破坏。”当时，没有现成的显微镜适用于科勒的研究，因此他在2005年决定自己制造一个。他设计的显微镜被称为数字扫描激光光片荧光显微镜（DSLM），可以在90秒内捕捉到一个发育中的斑马鱼胚胎中的每一个细胞。
并不是所有自己动手制造显微镜的人在开始设计时都有一个具体的研究问题。对于德国哥廷根马克斯•普朗克生物物理化学研究所的物理学家斯蒂芬•黑尔（Stefan Hell）来说，提出关于显微镜技术的新概念本身就是一个目标。他说：“这是一个科学项目。我这样做的目的是为了促进显微镜技术的发展。”
他在这方面取得了巨大的成功。2014年，黑尔与加州斯坦福大学的威廉姆•莫尔纳尔（William Moerner），以及白兹格共同获得了诺贝尔化学奖——他们发明了超高分辨率荧光显微技术，使研究人员能够在纳米尺度上使生物结构成像。
黑尔认为，尽管自己构建的一些显微镜设计已经商业化了，但生物学家一般不需要效仿，因为制造商会十分迅速地将新的构建想法投入生产。他自己的诺贝尔奖获奖设计，被称为“受激发射损耗”，或者STED，始建于1999年耗资20万美元。现在，它作为一个按钮操作系统，其大小是鞋盒的一半，可以附着在任何现有的共聚焦荧光显微镜上。黑尔表示，还有几家公司也在制造光片照明显微镜。
然而，科勒认为，光片照明显微镜的技术领域仍然相对不成熟，而且少数几个已经商业化的系统要达到科学研究的前沿的需求，还需要7到8年的时间。他说：“实际上，我们是不得不自己动手去建造所需的新型显微镜。”
这个过程必然是有利有弊的。定制系统在速度和分辨率方面是遥遥领先的，并且可以为特定的生物问题或系统而定制。但这是以灵活性为代价的。在一些自己动手制作的系统中，一些简单的事情做起来也并非易事。定制系统需要大量的时间和精力来构建和维护。
马里兰州贝塞斯达市的美国国家心肺血液研究所的一名细胞生物学家，克莱尔•沃特曼（Clare Waterman）表示，对于那些愿意接受挑战的人来说，回报是值得的。在20世纪90年代初，沃特曼利用新摄像技术开发了一种名为荧光斑点成像的技术，该技术可以用于研究细胞骨架和其它大型的多蛋白质复合体。
无论是为了促进显微技术发展还是为了解决一个特定的生物学问题，构建新型显微镜的过程基本上都是一样的。科勒在这方面经验丰富，他说：“我们会长期研究、构建新型显微镜。”他把这个构建过程简要地进行了总结（见下文“DIY显微镜的十个步骤”）。科勒表示，一个优秀的显微镜构建团队应该需要一个物理学家或生物医学工程师来管理这个项目，同时需要至少4位专业人士的支持：一位光学工程师进行光路设计；一位机械工程师研究如何将零部件组装在一起；一位软件开发者对机器进行编程；一位计算机工程师将原始数据转换成可用影像。
建造显微镜是一个复杂的过程，不过，菲利普•科勒将这一过程精炼为十个步骤：
• 集思广益，对要设计的新型显微镜进行研究讨论
• 计划并检测光路设计
• 利用计算机辅助设计软件来设计主体和定制的部件
• 订购零件，制造定制的机械和光学部件
• 借用组件来检测它们的性能和集成度
• 组装一个原型
• 编写显微镜控制软件
• 根据性能改进定制部件
• 进行原理论证实验
• 研发并改进图像处理软件
第一步是光路设计。利用专业软件——科勒和勒戈特使用的是华盛顿柯克兰的Zemax公司提供的软件“视觉工作室”——光学工程师在虚拟空间中工作，确定激光器、透镜、反光镜和其他光学元件的正确排列，以达到所需的分辨率，并满足相应的特性。
然后，机械工程师需要研究所有这些部件在现实世界中应如何组装在一起，就像将物理部件固定在一个光学台上一样。在珍妮莉娅法姆研究学院和科勒一起工作的布赖恩•库柏（Brian Coop）说：“此时，它只是排成一行的一束透镜，还漂浮在空中。我的任务就是要让它独自站立起来。”
库柏认为，这一阶段最大的挑战是要在极其严格的物理约束条件下工作。当显微镜必须聚焦于只有几微米甚至是纳米大小的物体时，几乎不容有任何差错。透镜、反光镜和激光器需要精确定位，才能产生有用的、焦距内的图像，而库柏需要考虑到，诸如金属热膨胀等微小的变化，可能会使它们发生偏离。库柏说：“注意光学校准的精度会使得一切后续工作都变得简单。”
库柏尽可能用现成的零部件来制造显微镜。但每台显微镜都需要一些定制的部件，因此库柏必须自己设计，有时会在珍妮莉娅法姆研究学院的机械车间里自己制造。
一旦光学工程师和机械工程师组装了一个原型之后，软件开发者和计算机工程师就会投入工作，以确保各部件能够协调、正常运作并产生有用的图像。珍妮莉娅法姆研究学院的一名计算机程序员丹尼尔•米尔琪（Daniel Milkie）表示，许多显微镜建造者使用一个叫做LabVIEW的商业程序包来控制他们的显微镜，但是当机器变得更高级时，有时需要一个定制解决方案。
米尔琪说：“我们正在设计新的工具和新型显微镜来提高硬件可达到的极限，所以需要设计专门的软件以达到最佳性能。”关键是要确保软件足够灵活，能够快速调整以满足新的需求，比如数量更多的探测器。因此，米尔琪使代码模块化，这意味着不必从头开始就可以很容易集成新的元件。
但是，米尔琪说，软件方面最大的挑战是如何处理显微镜产生的大量数据。高速摄像机每秒能产生十亿字节的数据，而一些显微镜可能有几个摄像头在同时运行。米尔琪表示，仅白兹格实验室每年就可以产生50～100兆兆字节的数据。他说：“我们已经创建了这个数据流，那么它将流向哪里呢?”
成品看起来和传统的显微镜没什么不同。所有的部件——反光镜、透镜、激光器、摄像头和样品腔——都被连接到一个重达几吨的桌子上的各种柱子和夹子上，并经过设计以使显微镜免受震动。勒戈特表示，这就像一套精心设计的乐高玩具。
科勒估计，从零开始制造一台显微镜至少需要一年的时间，但如果团队能够从早期的设备中回收零部件和软件，就可以减少所需时间。而且由于定制需要越来越高级，使得研发所需的费用变得越来越多。科勒于2005年设计的数字扫描激光光片荧光显微镜（DSLM）花费了大约5万美元，而后来设计的显微镜花费则高达10万～20万美元。他于2015年设计的最新版本——各向同性多视图显微镜——花费在100万美元以上。科勒说：“我认为，如今一个只花费5万美元就设计制造出来的显微镜不能说是对现有技术的改进。”
定制显微镜也需要使用更多的技巧，因为每个实验通常都需要进行大量的设置和校准——用户亲自动手的那种调整——商业制造商通常不会这么做的。但沃特曼认为，这不应该是一个障碍。她说：“这是显微镜基础课程中应该学的基本技能。”
涉及新型显微镜系统的已发表研究中通常包括设计计划和零部件清单。对于那些想要了解相关技能的人，可以从网络上获取珍妮莉娅法姆研究学院有关显微镜的设计计划和软件，该学院还为显微镜的构建过程提供帮助。勒戈特说：“有大约20个小时的视频教程讲解如何组装并调准所有的零部件。”此外，还有其它可以获得专业技能的渠道。例如，马里兰州贝塞斯达的美国国家生物医学成像和生物工程研究所的高分辨率光学成像部的一位生物物理学家哈里•什罗夫（Hari Shroff）开创的diSPIM.org网站；德国德累斯顿的马克斯普朗克分子细胞生物学与遗传学研究所的帕维尔托曼卡克发育生物学实验室创立的OpenSPIM.org网站；西班牙巴塞罗那的光子科学研究所的埃米利奥•瓜尔达（Emilio Gualda）负责的OpenSpinMicroscopy网站等。这些都免费提供各种光片照明显微镜的配置指导。
但是，尽管按照现有的计划去构建一个显微镜比从头开始设计一个要简单得多，但仍然需要光学、机械学、电子学、计算机编程和生物学方面的知识。瓜尔达说，最大的优势是价格。由OpenSpinMicroscopy网站提供的选择性平面照明显微镜的商业版售价约为20万美元。据瓜尔达估计，使用他的开源软件和像Arduino控制器这样的经济型硬件，研究人员可以制造出一种高级显微镜，而费用只需要大约5万美金，其中大部分花费在激光器和摄像头上。瓜尔达补充道：“你可以根据自己的具体需要去定制显微镜。”
用户还可以从一些在线论坛上得到建议和交易技巧。马萨诸塞州波士顿的哈佛医学院的一位分子生物学家，斯理戈库尔•尤帕德雅友拉（Srigokul Upadhyayula）曾于2014年在珍妮莉娅法姆研究学院与勒戈特一起构建了首台晶格层光显微镜，他认为，这种合作表示这些科学家的工作方式发生了巨大变化。他说：“这样的合作在该领域是很少见的，因为在过去每个人都曾是孤立的。”
勒戈特目前正准备在北卡罗来纳大学教堂山分校建立自己的实验室。这将使他能够继续进行细胞生物学和显微镜设计方面的工作。他的首批项目之一将是重新探讨细胞如何移动的问题。他说：“我们已经用自己的最新系统解决了技术问题——只是还没有机会把它应用到那个特定的问题上。”现在，勒戈特已经建造出了做这项工作所需的工具，或许最终会得到他多年来一直在追寻的答案。
参考文献：
https://www.nature.com/articles/d41586-017-07528-7
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